1材料與方法

1．1材料

水杉球果于2008年10月采自湖北利川水杉?jí)?，自然風(fēng)干裂開后將種子挑出。

1．2方法

1．2．1不同光照處理對(duì)種子萌發(fā)的影響以脫脂紗布作為發(fā)芽床，每個(gè)培養(yǎng)皿中鋪兩層脫脂紗布，包好滅菌待用。分別置于全光照、全黑暗、光照黑暗交替條件下（光照黑暗交替處理的光照時(shí)間為12h／d，以日光燈作為光源）于（25±2）℃培養(yǎng)。每處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)播種100粒種子。統(tǒng)計(jì)并計(jì)算其發(fā)芽率，發(fā)芽率＝15d內(nèi)發(fā)芽的種子數(shù)／供試種子總數(shù)×100％。

1．2．2室溫和4℃干藏條件對(duì)水杉種子萌發(fā)的影響經(jīng)室溫和4℃干藏條件處理的水杉種子，每15d取樣一次，用于萌發(fā)試驗(yàn)。將取樣的水杉種子于25℃水中浸泡12h，除去漂浮的種子。以鋪濕紗布的培養(yǎng)皿為發(fā)芽床，每個(gè)培養(yǎng)皿中播種100粒水杉種子。每個(gè)處理3次重復(fù)。在（25±2）℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行全黑暗處理，觀察記錄。對(duì)室溫和4℃干藏條件下材料每隔15d進(jìn)行取樣，每次取樣品10份，每份0．3g。經(jīng)液氮速凍后，置于－70℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．3酶液的制備用取自不同處理?xiàng)l件下的樣品0．3g，加入0．1g聚乙烯吡咯烷酮，2．0mLpH值7．8的磷酸緩沖液，于冰上研磨成勻漿，分裝于2mL的離心管中，冰浴上靜置1～2h。4℃、12000r／min離心20min，重復(fù)3次，取上清液，得到酶液，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．4POD活性的測(cè)定采用聯(lián)苯胺比色法測(cè)定POD活性。取稀釋10倍的酶液0．5mL，加入1mL聯(lián)苯胺醋酸－醋酸鈉緩沖溶液，30℃水浴保溫5min。測(cè)定時(shí)加0．5mL0．1mol／L的H2O2，立即搖勻，并轉(zhuǎn)入比色皿中，于波長(zhǎng)580nm處測(cè)定吸光度，從加入H2O2起計(jì)時(shí)，每15s讀數(shù)一次。按下式計(jì)算樣品中POD活性。E＝△OD（15－45）×2×稀釋倍數(shù)／1000。

1．2．5SOD活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑（NBT）法［10］測(cè)定SOD的活性。取4支5mL的指形管，其中3支為測(cè)定管，1支為對(duì)照管，按表1加入各溶液。

混勻后將對(duì)照管置暗處，其他各管于4000lx日光燈下反應(yīng)2min，之后用黑布終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后以不照光的對(duì)照管做空白，立即將測(cè)定管置于560nm處測(cè)定其他各管的吸光度。已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50％為一個(gè)酶活性單位表示，按下式計(jì)算SOD活性。SOD總活性＝（ODCK－ODE）×V×2／ODCK×W×VT。

1．2．6可溶性糖含量的測(cè)定采用蒽酮比色法。取11支2mL的EP管從0～10分別編號(hào)，按表2加入溶液和PBS。按順序向EP管中加入0．1mL蒽酮乙酸乙酯試劑和1mL濃硫酸，充分振蕩，在沸水中保溫1min。取出自然冷卻，以空白管做對(duì)照。在630nm下測(cè)吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取0．4mL稀釋200倍的酶液，加0．1mL蒽酮乙酸乙酯和1mL濃硫酸，充分振蕩后，在沸水中保溫1min，取出自然冷卻后測(cè)樣品的吸光度。